分光光度計采用一個可以產生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產生特定波長的光源，光線透過測試的樣品后，部分光線被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。  
上海菁華721可見分光光度計工作原理：  
單色光輻射穿過被測物質溶液時，被該物質吸收的量與該物質的濃度和液層的厚度（光路長度）成正比，其關系如下式：  
A=-lg(I/I0)=-lgT=kLc  
式中:A為吸光度；  
I0為入射的單色光強度；  
I為透射的單色光強度；  
T為物質的透射率；  
k為摩爾吸收系數(shù)；  
L為被分析物質的光程，即比色皿的邊長；  
c為物質的濃度；  
物質對光的選擇性吸收波長，以及相應的吸收系數(shù)是該物質的物理常數(shù)。當已知某純物質在一定條件下的吸收系數(shù)后可用同樣條件將該供試品配成溶液，測定其吸收度,即可由上式計算出供試品中該物質的含量。在可見光區(qū)，除某些物質對光有吸收外，很多物質本身并沒有吸收但可在一定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過處理使其顯色后再測定,由于顯色時影響呈色深淺的因素較多，且常使用單色光較差的儀器，故測定時應用標準品或對照品同時操作。
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